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Ganas de matar aumentando...

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Re: Ganas de matar aumentando...

Mensaje por Jorge M. L. el Vie Mar 11 2016, 00:46

Se supone que tienes que hacer un cultivo (B) en el antibiótico cuyo gen R has restringido y comparar las calvas del cultivo B con el cultivo inicial (A) que no ha sido tratado con antibiótico. Lo que no entiendo es de qué te sirve comparar el cultivo A con el B. Las colonias de A que coincidan sobre las calvas de B ¿por qué se supone que damos por hecho que son recombinantes ? Vale que B antes de ser tratado con el antibiótico sea un duplicado de A, pero dudo mucho que la transformación tenga exactamente la misma eficacia en exactamente las mismas zonas tanto en A como en B.
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Re: Ganas de matar aumentando...

Mensaje por alodnamra el Vie Mar 11 2016, 01:16

Entonces es que el proceso con pBR322 no es como yo lo he pensado. Yo hago algo parecido pero en Streptomyces, cuando quiero delecionar un gen, lo hago remplazándolo por una resistencia, y en el vector va otra resistencia adicional como control (se necesita un doble sobrecruzamiento para que haya remplazamiento). Entonces cuando yo por fin tengo colonias que ya he seleccionado con el antibiótico A (el que quiero tener en el mutante reemplazado), lo que hago es coger un palillo y, una por una (normalmente pico unas 50), siembro simultáneamente en dos placas: una que sólo contiene antibiótico A, y otra que contiene el antibiótico A y el B. Pero sobre todo, lo hago de forma controlada: divido la placa en cuadros, para estar seguro de que siembro el mismo clon en ambas en el mismo sitio. Al crecer, aquéllas que tienen la resistencia a A pero no a B son las que quiero, y eso lo veo porque donde hay B no han crecido; así que acto seguido me voy a buscarlas a A para crecer más y seguir trabajando.

Si, como tú dices, hay que compararlo con un cultivo que no está tratado con antibióticos, entonces yo tampoco le veo el sentido, porque ahí podría crecer de todo: con el plásmido restringido, con el plásmido natural, o sin el plásmido, y eso no tiene ninguna utilidad. Ahora, si haces una selección simultánea como la que yo te he descrito, entonces sí podrías. Es tedioso y hoy día existen miles de formas mejores que andar picando mil colonias de E. coli para encontrar la adecuada, pero como concepto en su momento debió de ser la leche.
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